梯度洗脱_百度文库

发布者:admin 发布时间:2019-10-25 18:25 浏览次数:

  第六章 梯度洗脱 1,引言 2,梯度洗脱的应用 3,梯度洗脱的原理 4,建立梯度分离 5,实验问题 6,梯度洗脱方法建立的总结 1,引言 等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变, 而在梯度洗脱中流动相组 成随运行过程是变化的。梯度洗脱中一般采用二元(溶剂)流动相: A 与 B,其中强溶剂 B 的浓度(%B)在运行过程中逐渐增加。其中线,梯度洗脱的应用 常规的梯度洗脱分离适合于下列样品: (1)具有较宽 k 值范围的样品 (2)大分子样品 (3)样品含有晚流出干扰物,它们会污染色谱柱或在后续运行中流 出。 (4)溶于弱溶剂的样品称溶液 即使最终有可能使用等度方法,初始试验采用梯度洗脱往往是 HPLC 方法建立的最佳起点。 2.1 梯度洗脱用于常规分析 (1)样品的保留值范围 选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。 前面谱峰需 用较弱流动相,而后面谱峰需用较强流动相。 采用梯度洗脱的另一个原因是,在等度洗脱条件下,k>20 的晚流出 峰往往会出现较严重拖尾。 (2)大分子样品组分 大分子量样品(肽、蛋白质、合成聚合物等)一般采用梯度洗脱分离 会更好,尤其用反相分离条件时。这类样品的等度保留往往对于流动 相组成(%B)的微小改变极其敏感,难以将保留值控制在合适的范围 内。 (3)晚流出组分 有些样品采用等度洗脱可很好地分离, 但所含有的晚流出干扰组分会 污染色谱柱或对后续分离产生干扰。 (4)增强检测灵敏度 梯度洗脱可增强检测,与相应的等度洗脱分离比较,样品峰变窄约两 倍(且峰高增大 2 倍)。 (5)稀样品溶液 对于溶解于弱溶剂中稀样品,梯度洗脱可以采用在体积进样,而不会 引起峰展宽。 (6)梯度洗脱的替代方法 有时,即使样品保留值范围超出 0.5<k<20,仍是采用等度洗脱较 好。用极性较强的反相柱(如氰基柱)通常可以缩小保留值范围。极 性的弱保留组分易与强级性固定相发生作用, 而非极性组分与其作用 较弱。 对于某些样品,通过柱切换代替梯度洗脱也很方便。 2.2 梯度洗脱用方法建立 当对组成未知的样品进行 HPLC 方法建立时,即使最终分离拟用等度 洗脱首先采用梯度洗脱仍有以下益处: A,初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围,为后续实 验应该选用等度或梯度洗脱提供必要的依据。 B, 若等度洗脱是较好选择, 初始梯度实验可为进一步实验提供最佳%B 的估计值。若梯度洗脱更合适,则初始实验可为下一步的梯度洗脱估 计出开始和终止%B 的最佳值。 C,初始梯度洗脱实验可以使整体样品分离更好、更快(与等度分离 相比),对方法建立极为有利。 D,初始梯度实验遗漏早与晚的低浓度组分的可能性不大。 (1)用等度还是梯度分离? 通过谱图中标出的初峰和末峰的保留时间(tRa 和 tRz)确定。保留 时间差 ΔtR=tRz – tRa,则比值 ΔtR/tG 可以决定等度分离是否可 行。最大允许 k 值范围为 0.5<k<20,此时 ΔtR/tG 应小于 0.40, 也就是说,该样品保留值范围应小地梯度时间的 40%。 (2)估计最佳等度条件 如果实验表明采用等度条件较好,则等度实验的最佳%B 值可由下表 确定。梯度分离中末峰的保留时间 tRz 可用于估计最佳%B 值,该值 在样品的等度分离中可使末峰的 k 值较理想。 由梯度洗脱中末峰保留时间 tRz 估计出的等度运行的%B(ACN)值 tRz(min) 等度运行中末峰 k 值对应的%B 估计值 k=5 k=10 k=20 5 6 0 — 10 19 12 5 15 29 22 14 20 37 30 22 25 45 38 30 30 53 46 38 35 61 54 46 40 69 62 54 45 77 70 62 50 85 78 70 55 93 86 78 60 100 94 86 65 — 100 94 (3)估计最佳梯度条件 如果实验表明样品更适于梯度条件,可由下表估计分子量小于 2000 样品的初始和终止%B 的最佳值。 基于初始梯度运行中的首峰和末峰的保留时间估计梯度洗脱的起始 和终止%B tRa 或 tRz(min) 起始%B 终止%B 5 3 14 10 11 22 15 19 30 20 27 38 25 35 46 30 43 54 35 51 60 40 59 68 45 67 76 50 75 84 55 83 100 3,梯度洗脱的原理 梯度洗脱中,流动相强度(%B)在分离过程中逐渐增加。也就是说随 样品迁移过色谱柱中,以 k 衡量的样品各谱峰的保留值是减小的。 梯度洗脱的有效 k 值等于谱峰在柱上迁移至一半路程时的 k 值。 梯度洗脱中 k 的平均值定义为 k*,与等度分离一样,它决定样品的 分离度和峰宽。 k*近似为常数值是反相线性梯度分离的主要特征 因此, 近似为常数值是反相线性梯度分离的主要特征。 不同峰的 k*近似为常数值是反相线性梯度分离的主要特征。因此, 线性梯度色谱图中每一谱峰具有相似的峰宽。 线性梯度色谱图中每一谱峰具有相似的峰宽。 3.1 梯度与等度洗脱 等度分离中的每个谱峰在穿过色谱柱的过程中, 被组成恒定不变的流 动相(%B)所包围,由容量因子 k 衡量的某一谱峰的保留值在分离过 程中保持不变。但在梯度洗脱中,一谱峰在穿过色谱柱的过程中周围 的流动相是改变的,该谱峰的即时 k 值也是在变化的。另外,等度色 谱图中被分离的谱峰通常具有不同的 k 值, 而在梯度洗脱中不同谱峰 的有效 k 值(k*)却几乎相同。 式中 GS 为梯度变化速率, %/min; 为流速, F mL/min; 为柱死体积, Vm mL。 若已知某一样品需用梯度洗脱,选择 k*≈5 进行初始试验较为合适, 这样可以兼顾分离度、能方便检测的峰高和运行时间。 3.2 梯度变化速率的影响 由于等度与梯度洗脱的相似性, 较大 k*值的影响应与较大 k 值一样: (1)k*增加,分离度 Rs 开始先增加,然后达到平衡;(2)谱峰伴 随峰高相应减小而展宽;(3)运行时间延长。 %/min(梯度)的增加类似于%B(等度)的增加 梯度 k*的增加类似于等度 k 的增加 梯度洗脱的方法建立几乎同等度分离一样。首先优化保留值(k*), 然后按需要改变选择性(α),最后可调节柱条件(N)以兼顾改善 运行时间和分离度。 3.3 梯度范围的影响 梯度范围指梯度起始和终止%B 的差值。初始的试探性实验可进行一 次全范围梯度(即 5→100%B)。 足够大的初始%B 值主要影响色谱图中的前部谱峰,使它们的 k*值降 低;峰变窄;分离度降低。 如梯度过早结束(末峰离开柱之前),通常应增加运行时间,并使后 面谱峰变宽(检测灵敏度下降)。 4,建立梯度分离 梯度方法建立的步骤可总结为: (1)以等度分离的相同方式选择初始条件:色谱柱,流动相组成, 流速,温度等;首次梯度试验却应采用较宽的梯度范围。应先优化初 次实验的 k*,梯度变化速率不能太陡。 (2)再调节梯度范围以缩短运行时间,去除色谱图开始和结束时无 用的空间。 (3)如出现谱峰重叠或运行时间太长,则需改变选择性(α)。 (4)优化峰间距后,改变柱条件以改善分离度和/或运行时间。 (5)制定平衡柱的最佳方法,并考察仪器差异对分离的影响。 4.1 选择梯度条件 (1)梯度变化速率 如 已 确 定 最 终 方 法 采 用 梯 度 洗 脱 , k*≈5 是 良 好 的 首 选 。 选 择 15×0.46cm、5μmC8 或 C18 柱、流速 2ml/min 较好。通常,初次分 离宜用全范围梯度:5→100%B(△%B=95)。梯度时间 tG。 (2)梯度范围 如初始梯度实验条件进行(60min 梯度,5→100%B;15×0.46cm 柱; 2ml/min;k*≈17),起始%B 与终止%B 的最佳值可由前表估计出。然 后进一步优化梯度范围。初始运行之前已确定需用梯度洗脱,小分子 (<2000)最好先采用 20min 梯度试验。 4.2 改变峰间距 在梯度洗脱中改变选择性与峰间距可通过与等度分离相同的方式实 现 [即通过改变 k 和 k* (等度洗脱的%B、 梯度洗脱的梯度变化速率) , 溶剂类型,色谱柱型,pH,HPLC 方法,温度等]。反相分离中性样 品时,用于改变选择性的变量的优先次序排列为:首先是流动相强度 (k*),其次是溶剂类型(乙腈>甲醇>THF),柱型(C8 或 C18> 氰基>苯基),最后是温度。对于离子样品,pH 和温度是控制选择 性的重要因素。 (1)梯度变化速率 在等度分离中改变%B 可使 k 和 α 发生变化;在梯度洗脱中,可通过 改变梯度变化速率 Gs 达到相当的效果。在梯度洗脱中改变梯度变化 速率或(k*)导致 α 和峰间距的改变可能要比在等度分离中改变%B (k)大得多。因此,通过改变 k 或 k*来控制峰间距在梯度洗脱是比 在等度分离中有效得多。 (2)溶剂类型 改变有机溶剂为等度分离中改变选择性的一种常用手段, 尤其对于中 性样品。 在梯度洗脱中改换有机溶剂也可获得类似效果。 (3)其它条件 梯度洗脱选择性的改变与其它条件有关(主要针对离子样品):pH, 离子对试剂浓度,温度。 4.3 调整色谱柱条件 当针对参数 k*和 α 优化了保留值以后,再改变柱长、固定柱颗粒大 小和流速等柱条件,还可进一步改善分离。等度分离中,改变柱条件 对 k 无影响,但梯度分离 k*依赖于柱尺寸和流速。k*的恒定需保持 Gs=(Vm/F)(△%B/tG)不变。如仅改变微粒大小则不需要改变梯度 时间以保持 k*恒定。 5,实验问题 5.1 设备对分离的影响:系统的滞留体积 (1)设备差异 用于梯度洗脱的仪器有两种:高压混合系统和低压混合系统。高压混 合系统在泵后(高压状态下)立刻混合 A 溶剂与 B 溶剂,而低压混合 系统在泵前混合溶剂。 梯度设备的设计对分离的主要影响在于“滞留” 体积(VD)。其它条件相同时,低压混合(LPM)系统的 VD 值较大。 包括自动进样器在内,VD 值范围一般为 2~8ml,但管路安装不好的设 备滞留体积值会超过 10ml。 (2)不同 HPLC 分离效果的差异 不同设备滞留体积对梯度分离时的主要影响是使样品保留时间发生 变化。增加的滞留体积相当于在梯度开始时增加的等度延迟。由于不 同 HPLC 系统的滞留体积不同,流动相问题可通过延长柱平衡时间加 以避免。所需的延长时间等于增加的滞留时间。 (3)减小设备滞留体积的影响 因为滞留体积的差异是梯度方法在不同系统之间不能很好移置的主 要原因,在方法建立步骤中有必要阐明原系统的滞留体积。减小不同 滞留体积对分离效果影响的办法有三种: 第一 (最好的) 某些系统控制器可以在梯度开始后的精确时间进样。 , 如延迟进样时间 tD,梯度和样品可同时到达柱进口。 第二,如梯度过程开始可插入一段等度过程,用 VD 值较大的系统时 则可以缩短这一过程;而用 VD 值较小的系统时则可延长这一过程。 以此方式,样品和梯度则会同时达到柱进口。 第三,以一较陡梯度从 5%B 至初始%B 开始。 5.2 可重现的分离 (1)柱再生 在梯度洗脱末尾时保持 100%B 或快速将梯度改变至 100%B 一段时间 (如 2~5 倍体积),以便采用强溶剂来清洗柱子。 (2)柱平衡 梯度洗脱中,的早期谱峰的保留值和分离效果会发生改变。柱平衡一 般需要 5~10 倍柱体积的初始流动相。最好在进样和下一次梯度开始 之前,用初始流动相彻底平衡色谱柱。如不能彻底平衡柱子,色谱图 中为达到柱平衡,还可以使梯度反向运行。 (3)不准确的梯度 分离重现性较差也会由梯度的不准确引起。 梯度不准确更易导致不同 梯度系统之间的分离产生差异, 当怀疑保留时间发生变化是由梯度混 合不准确所致的%B 随机波动而引起时,通过避免使用储液器中的纯 溶剂 A 和 B,可降低此问题的发生。 5.3 基线问题 梯度中的基线漂移和人工峰比等度洗脱中普遍得多。 (1)漂移 梯度洗脱中,基线向上漂移非常普遍,通常由所用 A 与 B 溶剂的紫外 吸收差异所致。在反相梯度洗脱中,有机溶剂 B 浓度在分离期间是增 加的,有机溶剂的紫外吸收总是大于水,因此,采用紫外检测器时, 这种梯度漂移尤为普遍。 梯度洗脱中的第二类基线漂移,可由空白梯度的弯曲基线来识别,最 大信号接近 50%B。此种基线漂移由折射率(RI)引起;有机-水溶液 通常在约 50%有机物时 RI 值最大。 (2)人工峰 当进行空白梯度实验时,尤其用短波长 UV 检测和高灵敏度设置时, 色谱图中可能会出现很大的谱峰。这类人工峰会(明显地)使梯度洗 脱的方法建立复杂化。 这种干扰通常由与流动相和设备有关的疏水且 有 UV 吸收的杂质引起。 6,梯度洗脱方法建立的总结 (1)开始前:首先应进行一次空白梯度,以确保基线没有问题(漂 移或人工峰)。 (2)运行实始梯度:采用 60min 线%乙腈-缓冲液, 流速 2mL/min,确证梯度洗脱是否必要,然后估计这种样品的最佳初 始和终止%B 值(梯度范围)。如肯定需用梯度洗脱,以 20min 梯度 开始(k*≈5)。 (3)优化梯度变化速率:估计最佳梯度范围,估算梯度时间并进行 这一条件下分离。 (4)优化条件:若需改善峰间距和分离度,可按等度分离的相同方 式试验,以进一步改变选择性。 (5)复合梯度:有些情况下,分段梯度可缩短运行时间和/或增加分 离度。应尽可能不用曲线)优化色谱柱条件。 (7)其它问题:一旦选定了分离样品的实验条件,应使色谱柱达到 平衡,以保证在试图减小整体运行时间时(包括柱平衡时间),早出 峰的保留可重现。样品间的平衡体积应尽可能大些。 第七章 常规样品反相分离的系统方法 1,引言 2,开始 3,完成等度方法建立 4,完成梯度方法建立 1,引言 本章总结了用反相色谱法(RPC)分离时选择恰当实验条件的初步构 想,并描述了将前一次的实验结果用于下一步实验条件设定的方案。 采用这种试一试法进行研究,直到得到满意的结果。 反相 HPLC 分离的总体方案 (1)确定样品属于常规的还是特殊的;若是常规样品,照本章提供 的方法进行研究。 (2)选择分离条件,进行第一次运行。 (3)做初次运行 a.等度方法; b 对梯度方法; c 对弱保留样品,由(1)改变 pH;(2)加入离子对试剂;(3)改变柱子 (一般键合相或交联柱)或(4)改用正相条件,来增加保留; d.对强保留样品,用(1)NARP 或(2)正相条件。 (4)对等度方法,用初始梯度运行来估计第二次(等度)运行的最 佳%B 值。 (5)评价第二次运行中峰的质量(塔板数、峰宽、峰形)。峰太宽 或不对称说明初始分离条件(柱子、pH,添加剂等)必须改变;若二 次运行良好, 应作进一步平等实验以保证柱平衡和可重复的保留时间。 (6)a.对等度方法,改变%ACN 来改善峰间距和分离度; b.若有必要,从 ACN 改为 MeOH 并为峰间距和分离度优化%MeOH; (7)对等度方法,若步骤 6a 或 b 的分离不充分,则按照柱类型、温 度、THF 作溶剂、不同的 C18 柱的顺序改变条件; (8)对梯度方法,用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离 度; (9)对梯度方法,按上一章所确定梯度条件(初始和最后%B,梯度速 度变化,梯度形状)改善分离度或缩短运行时间; (10)对等度或梯度方法,改变一个柱条件(柱长、流速、填料尺寸) 可以提高分离度或降低运行时间。 1.1 一些指导原则 (1) 样品分类 常规样品的分离可通过改变溶剂浓度(%B)和类型(乙腈 ACN,甲醇 MeOH)(或柱温)找到合适的分离条件。浓度%B 降低 10%一般使保留 值增加 3 倍,选择性通常随溶剂浓度或类型的变化而变化。柱温的上 升会引起保留值的下降(1~2%/℃)和选择性的变化。 (2)初始分离条件:色谱柱和流速 反相 HPLC 方法建立的初始条件 分离变量 柱填料 最佳的初始条件 C8 或 C18; 弱酸性硅胶; 若设计温度>50℃, 选择更稳定的空间保护填料 柱结构 流速 流动相 15×0.46cm,5μm 填料 2.0ml/min 乙腈-水(中性样品)或乙腈-缓冲液(离子型 样品);缓冲液为 25~50mM 的磷缓冲液 pH2~3(若色谱柱稳定,pH 最好 更低)。对初始试验,可用 60min 内 5→100%B 的梯度 温度 进样量 35 或 40℃ <50μl;50~100μg 色谱柱也应提供(1)初始实验时对样品有合理的分离度, (2)短的运行 时间(包括色谱柱的平衡和平行实验),(3)对不同流动相有合适的压 力降。5μm,15×0.46cm 色谱柱,流速为 2ml/min 一般是较佳选择。 这些条件提供了(1)合理的塔板数(N≈8000),(2)运行时间<15min, k<20,和(3)由水、乙腈和/或甲醇的混合物制成的任何流动相的最 大压力<2500psi,对于快速分离 7.5×0.46cm,3.5μm 填料的色谱 柱是较好的选择。 (3)初始分离条件:流动相 要求流动相无紫外吸收且低粘度,较好满足这些条件的有机溶剂是 ACN。MeOH 也是一种适合作为 HPLC 分离的流动相有机溶剂,初始流 动相 pH 值的选择基于两点考虑。(1)选用低 pH 可以使柱硅羟基质 子化并降低其色谱活性;(2)低 pH 值(<3)与常见酸碱官能团的 pKa 值相差较远,对于在低 pH 下稳定的色谱柱,选 pH 在 2~2.5 之间 较合适。对不太稳定的柱子,选 pH3 更好。 在方法建立的早期试验中应避免使用三乙胺和离子对试剂等流动相 添加剂。 (4)其它初始分离条件 可通过选择柱温达到不同的分离目的。基本要求是柱温恒定。由于高 温下流动相粘度降低,有较低操作压降和更高的塔板数,通常开始选 用 35℃或 40℃的柱温。可能的线mg/mL)或乙腈 的稀水溶液来溶解。对于最终的 RPLC 方法,溶解样品的最佳溶剂是 流动相,可用乙腈或甲醇溶解并在进样前用水或流动相稀释。先进样 25~50μl(25~50μg)以得到最大检测灵敏度。 (5)确保准确的保留数据 当色谱柱,流动相或温度发生变化时,进样前都要求用 10 倍柱体积 (对 15×0.46cm 的柱子是 15mL)的新流动相来平衡。 在开始阶段,应改变流动相或柱温而不是色谱柱,因为流动相和柱温 的改变可以连续进行,更有可能找出多组分样品的最佳选择性。同时 这也比改变色谱柱更方便。 严格按照下述规程操作可以保证柱平衡和数据重复性:(1)用至少 10 倍 于 柱 体 积 的 新 流 动 相 清 洗 色 谱 柱 ( 对 流 速 为 2mL/min 的 15×0.46cm 的柱子需 8min);(2)进样;(3)用至少 5 倍于柱体 积的流动相清洗色谱柱;(4)再次进样。 若 色 谱 柱达 到平衡 , 在 两次 运行之 间 保 留时 间的改 变 应 不超 过 0.02min。 由于色谱柱被污染或键合相流失,色谱柱的保留性能可能会变化,这 意味着不同时间得到的保留数据没有可比性。 (6)确保好的柱性能 第一步或第二步试验运行完成, 更重要的是考察色谱图的峰形和塔板 数。对一个 15cm,5μm 的色谱柱,流速为 2mL/min 时,不对称因子 应在 0.9~1.5 之间(0.9~1.3 间更好),分子量小于 1000 的样品,等 度洗脱的塔板数应>4000。在梯度运行情况下,半峰宽不应大于 0.4min。 方法建立中不断出现拖尾峰或展宽峰会浪费相当多的时间和 精力以改善柱性能。 (7)峰跟踪 峰跟踪是指改变实验条件时, 在两次运行之间对同一组分谱带的匹配。 2,实验开始 2.1 初始条件 对常规样品,先使用上表中的条件:15cm,5μm 的 C8 或 C18 柱,乙 腈-水流动相,2mL/min 的流速,柱温 35℃或 40℃(除非没有柱恒温 装置),和适当的进样量。对离子型样品,向流动相中添加 25~50mM 磷酸钾的缓冲溶液(pH2~3)。若不知道样品类型为中性还是离子, 最好用同样的缓冲液 pH 值。可用等度或梯度洗脱进行初始“试探” 分离。最好优先选用梯度分离,最初梯度可以先用 5→100%的乙腈, 60min。初次梯度运行可确定(1)推荐等度或梯度洗脱;(2)是否 需要特殊的反相条件。 2.2 调整保留值范围 RPC 方法建立的首要目标是选择能提供合适保留值范围的实验条件。 若等度洗脱可行,意味着 0.5<k<20;k 超出此范围,则有必要梯度 洗脱。但通常选择或需要选择等度洗脱。 (1)等度分离 △tR/tG 0.25 0.40 等度保留值 1<k<10 0.5<k<20 运用“三倍规则”,初次运行的最末谱带的 k 值可用来估计%ACN。有 机相浓度降低 10%可以使 k 值大约增加 3 倍。 (2)梯度分离 若起初的梯度分离 (实验 1) 表明等度洗脱不可行, 进一步的试验 (和 最终的方法)应以梯度方式。可用梯度表来决定下一次梯度运行最佳 初始和最终%ACN 值。 2.3 评价峰型和柱效 谱图中的一些谱带至少有部分分离时, 就可以测量和计算它们的峰宽 和对称性。必须注意峰的拖尾或扭曲,因为硅烷化相互作用将导致最 终建立的方法普适性变差。塔板数 N 低是存在的另一个问题(如对一 根 15cm,5μm,流速为 2mL/min 的色谱柱<4000 塔板数)。 3,完成等度方法建立 常规样品和等度 HPLC 分离方法建立的系统策略 实验 运行 1 60min 内 5→100%ACN 梯度 弱或强保留组分)? 1.2 样品用单一 RPC 分 离是否太复杂? 1.3 等度或梯度洗脱哪 个更好? 运行 2 从运行 1 和上表中选出%ACN 2.1 峰对称吗? 2.2 塔板数合理吗? 2.3 k 范围合理吗? 2.4 分离得好吗? 1.1 能用反相 HPLC 吗?(无 问题 2.5 运 行 3 应 使 用 何%ACN(增加还是降低 10%;改变 k 的 1/3 或 3 倍)? 运行 3 %ACN 增加 10% 什么? 3.2 分离得好吗? 运行 3a 运行 2 和 3 的最佳%ACN 吗? 运行 4 运行 2 和 3 用来估计最佳%MeOH 4.1 k 范围合理吗? 4.2 分离得好吗? 4.3 运 行 5 用 什 么%MeOH? 运行 5 %MeOH 增 加 10% 佳%MeOH 是什么 5.2 分离得好吗? 5.3 关键峰对在最 佳 ACN 和 MeOH 运行中 变化吗?(若变, 运行 6) 5.1 此 分 离 的 最 3.3 能肯定充分分离了 3.1 此分离最佳的%ACN 是 运行 5a 运行 4 和 5 的最佳%MeOH 运行 6 和 7 运行 2,4 及运行 3,5 流动相混合(1:1) 混合物可以充分分离吗? 运行 7a 优化水、甲醇和乙腈三元溶剂体系 了吗? 7.2 用 ACN-MeOH 混 合物的分离充分了吗? 优化柱条件。柱子长度,填料大小或流速的变化常被用来优化最终的 分离,特别是只要求分离度的微小提高时。 柱条件改变的特征(等度分离) 变量 降低流速 特征 能适度地增加分离度, 增加运行时间, 7.1 能确定分离充分 6.1 水/甲醇和乙腈 5.4 能确定充分分离吗? 降低压力,不会发生未知的选择性改变(相同的柱子) 增加柱长 分离度明显增加 运行时间和压力明显增加,可能有预 计不到的选择性变化 降低填料粒度 能较大提高分离度、运行时间和柱压 可能有预计不到的,选择性变化,更 短的柱子使柱外效应更重要 对填料<3.5μm 更易产生其它问题 (堵塞) 4,完成梯度方法建立 对常规样品和梯度分离 HPLC 方法建立的系统方法 运行 1 2.0ml/min;35~40℃ 运行 2 化速度到 5%/min; 检查运行 1 和 2 的难分离峰对;Rs>0.7 对 任何梯度变化速度都可能吗? 运行 3 运行 4 升温至 60~70℃,重复运行 2 的分离 将梯度时间增加 3 倍,重复运行 3 的分离; 根据上表调整初始和最终%B 值; 增加梯度变 60min 内 5→100%B ; 15×0.46cm 柱 , 检查运行 1 至 4 的关键峰对;对任何梯度速度或温度所有峰的 Rs 大 于 0.7 吗? 运行 5 运行 6 运行 7 若 Rs>0.7,在此条件下分离 若要求 Rs 增加,由改变柱条件来实现 若梯度速度和温度的增加不能使样品充分 分离, 研究甲醇或乙腈-甲醇混合物的使用(用更陡的梯度代替高比例 的有机相),若此法


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