柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方

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  柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立_化学_自然科学_专业资料。研究论文 生命科学仪器2005 第 3 卷 / 第 2 期 柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立 徐瑾 1 ,2 ,李彤 1 ,张庆合 1 ,张维冰 1 (1.中国科学院大连化学

  研究论文 生命科学仪器2005 第 3 卷 / 第 2 期 柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立 徐瑾 1 ,2 ,李彤 1 ,张庆合 1 ,张维冰 1 (1.中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁大连116011 ; 2.常州工程职业技术学院, 江苏常州213164) 摘要以 1- 苯基-3- 甲基-5- 吡唑啉酮 (PMP) 为柱前衍生化试剂, 建立了高效液相色谱等度洗脱分离分析5种单糖的 方法。 采用简化的衍生化方法, 在流动相: 乙腈-醋酸盐缓冲液 (0.1mol/L,pH=5.5, V/V=22∶ 78) 的色谱分离条件下, 5种 单糖衍生物可以达到基线ng, 也对方法的线性范围、 精密度、 稳定性进行了系统的考察。 关键词单糖, 1- 苯基 -3- 甲基 -5- 吡唑啉酮, 衍生化, 高效液相色谱, 等度洗脱 1前言 近年来,糖类物质在生物学领域的作用已越来越 被重视,人们将研究的重点放在糖类物质的定量、定 性以及结构分析上,并对此做了大量的研究。因为糖 的种类较多,且结构近似,所以无论对哪种糖进行分 析,首先必须将分析的对象与其它糖分离开来。另一 方面糖类物质几乎没有光学活性,对分离后的物质进 行直接光学检测比较困难,结合灵敏度、选择性等方 面的问题,人们多采用通过化学标记将糖类物质转变 为具有光学活性的物质, 然后再进行分离分析的方法。 衍生方法与高效液相色谱(HPLC)结合使用不但能提 高检测的灵敏度, 而且可以改善分离特性。 迄今为止, 文献报道的用于糖类物质衍生的紫外衍生试剂种类很 多[1-3], 它们都各有优缺点。 近年来出现的1-苯基-3- 甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是一种具有强紫外吸收的衍生 试剂, Honda等[4]发现该试剂可以与还原性的糖在温和 条件下反应, 无需酸催化, 不会引起脱甲硅基的作用, 产物无立体异构体, 在紫外245nm处有强烈的吸收。 该 [3-6] 方法自应用以来, 已得到了不断的完善 。 马定远等 [7] 在前人的基础上简化了其衍生化方法, 建立了单糖组 成分析的数据分析方法,并用所建立的方法对一个多 糖中的单糖组成进行了分析,获得良好的重复性。鉴 于该物质的这些优点,本文采用它对单糖进行柱前衍 生,结合 HPLC 技术,建立了5 种常见单糖的等度洗脱 分离模式, 通过外标法对这5种单糖进行了定量研究。 UV200Ⅱ紫外可变波长检测器 ; P200Ⅱ高压恒流泵 ; Echrom98工作站 (大连依利特科学仪器有限公司) ;真 空过滤器(天津市腾达过滤器件厂) ;H19321pH 计 (HANNA) ;DZF-150 型数显小型恒温真空干燥箱(郑州 长城科工贸有限公司) 。 2.2试剂 乙腈、 甲醇 (色谱纯) ; 三氯甲烷、 乙酸铵、 氢氧化 钠(分析纯);PMP(99%,ACROS);D-半乳糖、D-木 糖、 鼠李糖 (生化试剂) ;葡萄糖、 D-甘露糖 (分析纯) 。 2.3单糖-PMP衍生产物的制备 以葡萄糖 (Glucose) 为例, 将1mol的Glucose溶于 1.5mL 的 NaOH 溶液(0.3mol/L)中,取该溶液150 μ L 与100μL的PMP/甲醇溶液(0.5mol/L)混合, 在70℃下 反应 30min。取出后冷却至室温,然后加入150 μ L的 HCl(0.3mol/L)进行中和, 中和后的溶液放入线℃下烘干。烘干后的物质用2mL 的水及 2mL 的氯仿溶解, 充分振荡后除去有机相, 萃取过程重复3 次。水相溶液经0.45 μ m 的滤膜过滤后,用水稀释至 一定倍数,进样量 10 μ L 进行 HPLC 分析。 2.4HPLC条件 色谱柱 : HypersilODS2(150mm×4.5mmi.d.,5μm, 大连依利特公司);柱温 :室温; 流动相: A—醋酸盐 缓冲液 (0.1mol/L,pH=5.5) , B—乙腈 ; 流速 : 1mL/min ; UV 检测波长:245nm。 3结果与讨论 3.1衍生方法的选择 与其它文献[3-7]的方法不同, 无需将待测样品水溶 液真空干燥后再进行衍生,直接将待测样品溶解于 2实验部分 2.1仪器 *通讯联系人:张维冰, 教授, 电线, email:weibingzhang@dicp.ac.cn 国家“十五”攻关项目,高效液相色谱仪器研制与开发,编号:G 0 1 0 1 0 1 30 生命科学仪器2005 第 3 卷 / 第 2 期 研究论文 NaOH 溶液中,衍生试验时移取一定量样品溶液直接进 行衍生。 但是糖/NaOH溶液必须在低温下保存。 因为常 温下保存, 数天后衍生产物的峰面积明显减小, 并出现 了两个杂峰, 可能的原因是糖的醛基在碱性条件下容易 氧化。 而低温下保存可以有效地避免这种情况的发生。 在大多数文献[3-6]中,HCl 中和衍生溶液后,首 先将溶液真空干燥,再用水溶解,萃取完成后的水相 再一次进行真空干燥,最后的干燥物用水溶解进行 HPLC 的分析。 这些步骤以除去衍生反应中剩余的试剂 和产生的杂质为目的,因此 PMP 衍生方法操作复杂, 无法避免各个步骤中衍生产物的损失。有人用 PMP 衍 生时没有采取任何干燥步骤,直接进行萃取,多余的 衍生试剂虽然没有完全除尽,但是由于衍生试剂峰在 其它六种单糖的衍生产物峰前流出,所以并不干扰分 离分析, 这就在很大程度上简化了衍生试验的步骤, 衍 生产物几乎没有任何损失[7]。本文在采用该方法时发 现,在 Man 衍生产物的峰后有一个小峰(PMP) ,等度 洗脱无法与其分开 (如图1a所示) 。 采取一次干燥即可 解决这一问题,既达到了简化实验步骤的目的,降低 了衍生产物的损失,使得定量实验更加准确,又在最 大程度上使衍生试剂峰减小。 (如图1b 所示) 。 3.2有机萃取剂的选择 柱前衍生需要使用过量的衍生试剂以达到衍生完 全的目的, 但必须在样品进入HPLC之前除去过量的衍 生试剂,以清除衍生试剂的干扰,延长色谱柱的使用 寿命。分别选取常用的有机试剂——苯、氯仿、乙酸 乙酯、乙酸异戊酯、正己烷作萃取剂进行试验,除去 衍生反应中产生的杂质和残留衍生试剂。对衍生的最 后产物使用同样体积的不同有机试剂进行萃取,比较 了这 5 种有机萃取剂去除杂质的效果(用 PMP 剩余量 表示)和对衍生产物的回收率(用 Sugar-PMP 的回收 率表示) 。结果证明5 种有机试剂中, 氯仿在这两方面 的作用是最佳的。 其用量为PMP的200 倍 (体积比) 时, 三次萃取后 PMP 仅剩 2%,Glucose-PMP 的回收率可达 到 82.7%。对 PMP 衍生的其他单糖,如甘露糖、半乳 糖、木糖等,氯仿的回收率也令人满意。 采用乙酸异戊酯分两次萃取时,虽然萃取效率低 于氯仿,但各种单糖(甘露糖、葡萄糖和半乳糖)的 回收情况一致, 萃取各单糖峰面积的精密度在1.5%~ 3.5% 之间。采用氯仿萃取,一次萃取后鼠李糖、葡萄 糖、半乳糖的回收情况基本一致,但甘露糖的回收率 较高,同时木糖的回收率较低。二次萃取后,甘露糖 回收率减小。三次萃取完成后各单糖的回收情况非常 接近(在 80%~83% 之间) ,其(甘露糖、鼠李糖、葡 萄糖、 半乳糖和木糖) 峰面积的精密度 (RSD, n=3) 依 次为:3.15%、2.77%、2.90%、2.90% 和 2.99%。 图15种单糖衍生产物的色谱图 Fig.1HPLC-UVchromatogramofthePMP derivativesof5smallsugars (a)withoutdryingprocess;(b)withdryingprocess 3.3色谱分离条件的优化 选用醋酸盐缓冲液作流动相, 将Snyder等[8] 与卢等 提供的条件优化选择方案相结合, 经过分离条件选择 的系列试验 (包括缓冲液pH 值的选择, 乙腈含量的选 择) ,最终确定最佳等度分离的色谱条件:流动相A— 醋酸盐缓冲液 (0.1mol/L,pH=5.5) , B—乙腈, A ∶ B=78 ∶ 22(V/V) ,使用 4.5 × 150mm 的色谱柱,UV245nm 检 测,分离谱图如图1b 所示。 各种单糖的衍生物色谱峰 都达到了基线分离。文献中选用流动相:A-15%(V/V) 乙腈 +50mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH=6.9) ,B-40 为 % (V/V)乙腈 +50mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH=6.9) ;梯度 模式:时间梯度为0min → 9min → 25min,相应浓度体 梯度 0% → 10% → 55%B。应用此色谱条件,可以使上 述 5 种单糖获得相似的分离效果。但等度洗脱的方法 相对快速简便, 对色谱系统的要求不高, 且重现性好, 更具有普适性。 3.4标准曲线与检测限 采用外标法对 5 种单糖进行线 种单糖的标准品适量,经NaOH 溶液溶解并配制成一 [9] 31 研究论文 生命科学仪器2005 第 3 卷 / 第 2 期 系列摩尔浓度的工作溶液,依次进样10 μ L,根据 UV 测定的峰面积y对相应的糖的进样浓度x (mmol/L) 进 行线 种 单糖的峰面积与其绝对进样量之间呈良好的线性关系。 再将最小摩尔浓度的标准溶液逐级稀释进样,计算当 信噪比为 3 时所对应的标准溶液的质量浓度以确定检 测限,得到 Man、Rham、Glu、Gal 和 Xyl 的最低检测 限 (LOD) 分别为0.54、 0.54、 0.9、 0.9 和0.7ng。 表1五种单糖的线性范围及其最低检测限 糖 Carbohydrate Mannose Rhamnose Glucose Galacose Xylose 相关系数 Correlation coefficient 0.9995 0.9997 0.9981 0.9978 0.9991 标准曲线 Standurdcurve(n=6) y=3656.94x-184.15 y=3924.24x-209.23 y=2555.54x-327.56 y=2663.46x-249.19 y=2008.36x-302.02 线性范围 Linearrange (mmol/L) 0.025~ 5.0 0.025~ 4.0 0.025~ 5.0 0.025~ 4.0 0.025~ 4.0 9h、11h、13h、15h 和 25h 时进行 HPLC 分析。15h 内 Man、 Rham、 Glu、 Gal、 Xyl衍生物峰面积的精密度 (RSD, n=8)分别为 3.83%、2.82%、2.25%、2.52%、2.43%。 但在第15h 测定时, 衍生物峰面积已经开始有所降低, 尤其是 Man 衍生物的峰面积,Man、Rham、Glu、Gal、 Xyl 峰面积的减小率分别为 10.5%、6.12%、6.03%、 6.94%、6.8%。 4小结 本文采用 PMP 柱前衍生 -HPLC 等度洗脱法,建立 了 5 种常见还原性糖的定性定量分析方法。通过简化 的衍生方法,结合优化的等度HPLC 分析条件, 可以得 到较好的分离分析效果。建立的方法具有简易、实用 的特点,适用于简单糖类物质的快速分析。 参考文献 [ 1 ] WangJing (王静) ,WangQing (王晴) ,XiangWensheng (向 文胜) .ChineseJ.Anal.Chem. (分析化学) ,2001,29(2):222~ 227 MaoXiuli (毛秀丽) ,LinBingcheng (林炳承) .ChineseJ Chromatogr. (色谱) ,2001,19(4):309~313 ShigeoSuzuki,KazuzkiKakehi,SusumuHonda.Anal.Chem., 1996,68:2073~2083 SusumuHonda,EikoAkao,ShigeoSuzuki,MasahiroOkuda, KazuakiKakehi,JunNakamura.Anal.Biochem.,1989,180:351~ 357 StrydomDJ.J.Chromatogr.A,1994,678:17~23 ShenXiaodong,HelenePerreault.J.Chromatogr.A,1998,811: 47~59 MaDingyuan( 马定远),ChenJun(陈君),LiPing(李萍), Hu Zhuoyue(胡卓越).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化学),2002,30 (6):702~ 705 LloydR.Snyder,JosephJ,Kirkland,JosephL.Glajch.Practical HPLCmethoddevelopment.2nded.NewYork:JohnWiley& Sons,Inc,1997:247~278 LuPeizhang (卢佩章) , ZhangYukui (张玉奎) , LiangXinmiao (梁鑫淼) .HPLCanditsproficientsysterm (高效液相色谱法 及其专家系统) .Shenyang (沈阳) :LiaoningScienceandTech- nologyPress (辽宁科学技术出版社) .1992:143~299 3.5精密度试验 精密吸取 5 糖 -PMP 衍生物的标准溶液10 μ L,重 复进样 5次, 甘露糖、 鼠李糖、 葡萄糖、 半乳糖和木糖 的精密度(RSD,n=5) 分别为:0.23%、0.22%、0.17%、 0.17%、0.15%。 3.6衍生样品稳定性 不采取任何干燥手段的衍生化方法,从酸中和后 开始计时, 16h内各衍生物峰面积的精密度 (RSD, n=8) 在 1.6%~2.6% 之间,能够满足进行过夜分析的要求。 但在 10.5h 测定时,Man 和 Rham 衍生物的峰面积已经 有所降低。所以如果要获得更为准确的结果,最好在 8h内分析[8]。 本文所采用的衍生化方法, 酸中和后的衍 生产物经过干燥,干燥物常温放置,数天之内对衍生 产物的峰面积无任何影响。只要在分析前对干燥物进 行溶解、 萃取, 就可以获得非常准确的结果。 另外, 对 完成所有处理后的衍生化产物进行了稳定性的考察, 结果证明即使最终进样的衍生化产物也可以进行过夜 分析。 从用水溶解干燥物开始计时, 于1h、 3h、 5h、 7h、 [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] Methodestablishmentofanalysisofmonosaccharidebypre-column derivatization-highperformanceliquidchromatographywithequivalentelution AbstractAnewmethodusingequivalentelutionofreversed-ohasehighperformanceliquidchromatography(HPLC),andpre- columnderivatizationby1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP)wassetupfortheseperationanddeterminationof5reducing monosaccharidessimultaneously.Withthesimplifiedderivativemethod,andundertheoptimizedseparationconditions,whichwas consistedofarunningbufferof0.1mol/Lacetate,atpH5.5,containing22%acetonitrile(V/V),allthePMP-sugarscanbeseparated successfully,andresolvedwiththedetectionlimitsrangedfrom0.54ngto0.90ng.theprecision,Linearrangeandstabilityofthismethod wasalsostudied. Keywordsmonosaccharide,1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP),derivatization,highperformanceliquidchromatography, equivalent e lution 32


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